QIAxpert-Pure Revelation

جهت مشاهده تصویر بزرگتر بر روی تصویر زیر کلیک کنید
23
تعداد بازدید: 752

Sample QC made easy For accelerated DNA, RNA, and protein quantification and quality control Analyze up to 16 samples in 2 minutes Discriminate DNA and RNA in one sample

اطلاعات شرکت

زیست باران Zist Baran
شرکت - عادی (در انتظار عضویت)
موقعیت روی نقشه
ایران
تهران
 

برخی از محصولات این شرکت

توضیحات
جهت انجام بررسی های مختلف در زمینه شناسایی ملکولی , مهندسی ژنتیک و امور تشخیصی و تحقیقی ضرورت استخراج DNA از نمونه های مورد نظر وجود دارد. به طور کلی استخراج DNA از نمونه های مورد نظر را می توان به سه گروه کلی تقسیم بندی کرد. استحراج تمام DNA یا استخراج ژنومی از سلولها و بافتهای موجودات زنده که شامل کشت باکتری ها , ویروسها ,قارچها انگلها و نمونه های سلولی انسانی, حیوانی, جانوری و گیاهی یا هر نوع موجود زنده دیگر که در حال مطالعه است . این نمونه ها می توانند تازه یا نمونه های نگهداری شده در فریزر یا انواع مواد نگهدارنده مانند پارافین باشد از نمونه های بسیار قدیمی و تاریخی مانند انواع فسیلها مومیایی ها و استخوانهای کشف شده از هزاران سال قبل تر نیز می توان DNA استخراج نمود ولی به دلیل کهنگی بسیار و تاثیر انواع میکروبها و آنزیمهای تجزیه کننده , DNA این نمونه ها اکثراً به شکل تجزیه شده و کوتاه به دست می آیند. استخراج پلاسمید: پلاسمیدها DNA های خارج کروموزومی هستند که به طور طبیعی در میکروارگانیزم های خاصی وجود دارند. پلاسمید ها به شکل DNA های حلقوی است که در اندازه هایی از چندکیلو باز تا چندین میلیون باز در انواع میکروارگانیزم ها حضور دارند. پلاسمید ها به دلیل نقش مهمی که در فعالیتهای میکروبی مانند رمز نمودن مقاومت به آنتی بیوتیکهای ویرولانس و تولید سمّ و انواع فعالیت های دیگر ارزش بسیاری برای مطالعه دارند. در همین حال ابزارهای مهندسی اصلی ژنتیک جهت کلون کردن ژنها و بررسی فعالیت آنها می باشد. جهت این امر انواع پلاسمیدهای دیگر موسوم به کاسمید , فاژمید وYAC که در مخمرها استفاده می شود تهیه شده است. بنابراین جهت مطالعه حضور پلاسمید در میکروبها و همچنین مطالعات نو ترکیبی ضرورت استخراج DNA پلاسمیدی وجود دارد که به دلیل ضرورت جدا نمودن آن از DNA ژنومی روشهای خاص خود را دارند. 3- استخراج ژنوم فاژی : به دلیل اهمیت کاربرد فاژها در مهندسی ژنتیک تهیه’ DNA آنها ضروری است. که برای این کار پس از تکثیر فاژ در داخل سلول میزبان و جدا سازی فاژها به روشهای خاص استخراج DNA صورت می گیرد. استخراج ژنوم یا تمام DNA :اساس استخراج ژنوم از تمام نمونه های حاوی DNA یکسان می باشد ولی با توجه به این که چه کاربردی از این DNA مورد نظر است می توان از انواع روشهای مختلف استفاده نمود. این مرحل شامل موارد زیر می باشد. 1- آماده سازی نمونه ها 2- از بین بردن دیواره’ سلولی یا لیز کردن سلول ها 3- جدا کردن مواد غیر از DNA 4- خالص سازی DNA از ناخالصی ها 5 - تغلیظ DNA مرحله’ اول یا آماده سازی نمونه ها در این مرحله با توجه به نوع سلول یا بافت مورد نظر اقدام به تهیه’ مفادیر مناسب از آنها می شود. به عنوان مثال جهت استخراج DNA از باکتریها لازم است ابتدا مقادیر لازم از آنها را کشت داد و سپس در محیط مایع اقدام به جدا کردن باکتریها از مایع به کمک سانتریفوژ نمود. گاه لازم است جهت دقت بیشتر باکتریهای جدا شده را با بافر مخصوص شستشو داد تا آماده’ استخراج گردد. جهت تهیه’ نمونه های بافتی یا سلول های گیاهی لازم است مقادیر مشخص از آنها برای استخراج ژنومی آماده سازی گردند. مرحله’ دوم یا شکستن دیواره’ سلولی و یا لیز کردن سلولها با توجه به اینکه DNA یا ژنوم سلولها در داخل دیواره’ سلولی حفاظت میگردند لازم است برای استخراج آن ابتدا سلولها شکسته شده یا به نحوی لیز گردند. در برخی از سلولها مانند باکتریهای DNA دار DNA توسط دیواره’ سلولی و سیتوپلاسمی احاطه شده ولی در سلولهای حیوانی و گیاهی که واجد هسته می باشند دیواره’ هسته نیز وجود دارد که در حین عمل لیز کردن از بین می روند و DNA همراه سایر محتویات سلولی آزاد می شود. روشهای مختلفی جهت لیز سلولی و آزاد کردن محتویات آن وجود دارد که به دو روش کلی فیزیکی و شیمیایی تقسیم می شود. در روش فیزیکی با استفاده از فشار مکانیکی دیواره سلولی شکسته می شود که در این روش استفاده از ذرات شیشه, سونیکاتور (امواج ماوراء صوت با انرژی بالا ) و فشار مکانیکی و عبور خمیره’ سلولی از یک مجرای بسیار باریک تحت فشار بسیار بالا(French Press) که اغلب در ابعاد صنعتی و جهت شکستن سلولهای باکتریها , مخمرها و قارچها که در تولید محصولات استفاده می شود نام برد. در روش شیمیای از مواد شیمیایی و آنزیمها برای تجزیه دیواره سلولی استفاده می شود. به عنوان مثال برای لیز کردن سلول باکتریها از دو ماده’ شیمیایی یکی برای تجزیه دیواره سلولی و دیگری برای تجزیه دیواره’ سیتوپلاسمی استفاده می شود. با توجه به نوع ماده موجود در دیواره’ سلولی که در انواع باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی متفاوت است مواد مختلفی استفاده می شود ولی برای باکتری E.col و انواع مشابه آن که بیشترین کاربرد را در مهندسی ژنتیک دارد برای سست کردن دیواره سلولی از آنزیم لایزوزایم Lysozyme و یا ماده EDTA ( Ethylenediamine Tetra Aceterte ) و یا از هر دو استفاده می شود . لایزوزایم آنزیمی است که در تخم مرغ , اشک چشم و مخات موجود است و ترکیبات زنجیره ای که سبب استحکام دیواره های سلولی می شوند را هضم می کند از طرف دیگر EDTA با جذب یون منیزیم که عامل اساسی در حفظ استحکام پوشش سلولی است و در عین حال سبب ممانعت هضم DNA سلولی توسط آنزیمهای داخلی آن می شود ، سبب سستی دیواره’ سلولی شده و آماده جهت لیز شدن می باشد. در بسیاری از سلولها حضور این دو ماده سلول را آماده’ لیز شدن می کند. و لیکن در برخی از سلولها که دیواره’ سلولی محکم تری دارند مواد دیگری لازم است. لیز شدن سلولها با اضافه کردن مواد دترجنت مانند SDS سدیم ددو سیل سولفات Sodium Dodecyl Sulphate که جزء مواد متصل شونده به چربی است با اتصال به ملکولهای چربی دیواره’ سلولی سبب انفصال و در نتیجه پاره شدن دیواره’ سلولی می شود و در نتیجه’ لیز سلولی تمام محتویات سلولی شامل پروتئن ها ، اندامکهای داخل سلولی ، ذرات دیواره’ سلولی و سیتوپلاسمی DNA و RNA آزا د می شوند. مرحله’ جدا کردن مواد و DNA برای جدا کردن مواد اضافی از DNA میتوان از روشهای مختلفی استفاده کرد. 1- سانتریفوژ کردن : در این حالت ذرات درشت ، قطعات دیواره’ سلولی و مواد دیگر ذره ای رسوب کرده پروتئین ها ، DNA و RNA در مایع رویی قرار می گیرند. 2- استفاده از فنل و کلروفرم : مخلوطی مساوی از فنل و کلروفرم (1:1) سبب رسوب پروتئن ها می شوند ولی DNA وRNA در محلول رویی باقی می مانند که با سانتریفوژ دو لایه تشکیل می شود که پروتئن ها در بین دو لایه به شکل یک قشر سفید رنگ تجمع می یابد. مایع شفاف رویی حاوی DNA و RNA است که با جدا نمودن أن در یک لوله’ دیگر می توان اقدام به تخلیص DNA آن نمود. البته در زمانی که مقدار پروتئن عصاره’ سلولی بسیار بالا باشد ضرورت تکرار مرحله’ فنل و کلروفرم جهت جدا سازی تمام پروتئن ها وجود دارد که با توجه به حذف شکسته شدن مقداری DNA در هر مرحله بهتر است در این شرایط از أنریم های تجزیه کننده’ پروتئنی مانند Proteinaaseis یا Pronase قبل از مرحله’ فنل و کلروفرم استفاده کرد که با شکستن پلی پپتیدها به قطعات کوچکتر براحتی توسط فنل رسوب داده می شوند. برخی RNA ها بخصوص RNA های پیامبر با فنل حذف می شوند ولی اغلب أنها با DNA در مایع رویی می مانند که جهت حذف أن می توان به محلول DNA نهایی با Rnase اضافه کرد. استفاده از نمکهای رسوب دهنده’ پروتئن : برخی املاح مانند استات سدیم و پتاسیم سبب رسوب پروتئن های موجود در مخلوط لیز سلولی می شوند. در این روش با اضافه کردن این املاح به لیز سلولی مخلوط پروتئن ها و ذرات دیکر رسوب می کنند که پس از سانتریفوژ کردن بشکل توده ای سفید رنگ در ته لوله مشاهده می شود مایع شفاف رویی حاوی DNA و RNA و مقداری پروتئن های باقیمانده است که می توان با روش قبلی (فنل – کلروفرم) اقدام به رسوب أنها نمود. تغلیظ DNA : جهت رسوب DNA در محلول شفاف باقیمانده که حاوی DNA و RNA می باشد از اتانول خالص و سرد استفاده می شود اضافه کردن مقدار هم حجم اتانول و نگهداری آن در دمای سرد سبب رسوب DNA می گردد که جهت تکمیل این ترکیب از سانتریفوژ دور بالا استفاده می شود ( 15000- 14 دور به مدت 10 تا 25 دقیقه) سپس با خالی کردن لوله ها رسوب با اتانول 75% شسته شده و با خشک کردن در خلاء یا دمای اتاق می توان DNA خشک شده را در آب یا بافر حل نمود (شکل 3-6). استخراج پلاسمیدی : تمام مراحل استخراج پلاسمید مانند استخراج ژنومی است صرفاً در این روش سعی می گردد DNA ژنومی حذف شده و پلاسمید باقی مانده از آن جدا گردد. برای این کار می توان از NaoH استفاده نمود و با تغییر PH به حدود 12.5-12 با باندهای هیدروژنی بین ملکولهای DNA غیر پلاسمیدی باز شده و شکسته می شوند که در مرحله’ بعدی همراه پروتئن ها رسوب می شود در خالی که پلاسمیدها در محلول رویی باقی مانده و سپس جدا می شوند اضافه کردن سدیم استات به محیط قلیایی سبب این رسوب می شود. البته روشهای بسیار متعدد دیگری جهت استخراج DNA وجود دارد که از دقیق ترین آنها روش سزیم کلراید همراه سانتریفوژ است که به دلیل مشکل بودن و طول زمان استخراج تنها در مواقع ضروری از آن استفاده می شود (نیاز به DNA بسیار خالص ) . انواع روشهای ساده مانند روش جوشاندن Boiling جهت استخراج پلاسمیدها و شناسایی اولیّه باکتری های گرم منفی حاوی پلاسمید نیز وجود دارند که به طور کلی دارای مبانی یکسانی می باشند. DNA استخراج شده در مرحله بعد , از نظر کیفیت و کمیت مورد بررسی قرار می گیرد.


نظرات بیندگان
نظر شما
نام و نام خانوادگی :
ایمیل :
سوال یا نظر شما : ( لطفا اطلاعات تماس خود را وارد کنید) :

خانه چاپ ارسال به دوستان نسخه متنی کوچک کردن متن بزرگ کردن متن دانلود خروجی پی دی اف خروجی میکروسافت ورد
تعداد بازدید : 752
0/10 (تعداد آرا 0 نفر )