بلوک­های پلاستیکی (Plastic embedding)

بلوک ­های پلاستیکی (Plastic embedding)

تهیه ­ی بلوک­های پلاستیکی به­جای بلوک­های پارافینی، با توجه به طول کوتاه فیکساسیون به­کار می­رود باعث کاهش واکنش­های ایمونوهیستوشیمی و در این­گونه موارد استفاده از آنزیم­های پروتئولیتیک کمک­کننده است.

توصیه می­شود برای دکلسیفیکاسیون به­جای اسید نیتریک از اسید تری­کلرواستیک استفاده می­شود.

پردازش بافت (Tissue processing)

حرارت بالای ۶۰ درجه­ی سانتیگراد می­تواند باعث دناتوراسیون آنتی­ژن­های شود و علاوه بر آن مرفولوژی سلولی به­خصوص جزئیات هسته از میان برود. بنابراین بهتر است پارافین را در دمای کمتر از ۶۰ درجه به­کار برد. به این منظور اگر لازم باشد می­توان از پارافین­های با نقطه­ی ذوب پائین استفاده کرد. علاوه برآن برای خشک کردن برش­ها هم بهتر است به جای دمای ۵۸ درجه از دمای ۳۷ درجه سانتی­گراد استفاده شود.

 

روش رنگ ­آمیزی  (Staining procedure)

لازم به یادآوری است که هر مرحله در طی فرآیند رنگ­آمیزی ممکن است دچار خطا شود، مثلاً عدم مهار فعالیت پراکسیداز داخلی به ایجاد نتیجه­ی مثبت کاذب منجر گردد.

برای اکثر آنتی­بادی­ها زمان انکوباسیون در حرارت اتاق ۳۰- ۲۰ دقیقه است. اگر حرارت را به ۳۷ درجه­ی سانتیگراد افزایش دهیم می­توانیم زمان انکوباسیون را کوتاه کنیم، ولی ممکن است نتایج مثبت و یا منفی کاذب به­ دست آوریم و از طرفی ممکن است زمینه هم رنگ شود.

انکوباسیون در ۴ درجه در طی شب می­تواند بهترین روش باشد. به­خصوص که در این صورت کمترین غلظت آنتی­بادی هم مورد نیاز است، ولی در عمل انکوباسیون در حرارت اتاق در طی شب عملی­ ترین روش است.

در هیچ زمانی برش­های نباید شخک شوند چون در این صورت نتیجه­ی منفی کاذب خواهیم داشت.

تمامی انکوباسیون­ها باید در اتاقک­های مرطوب انجام شود.

روش آویدین بیوتین برای برش­های پارافینی

(Avidin – biotin peroxidase technique for parsffin section)

۱) برش­ها را دپارافینه می­کنیم.

۲) پراکسیداز داخلی را با محلول ۵/۰ درصد H2O2 در متانول به مدت ۳۰ دقیقه مهار می­کنیم.

۳) بافت از خشک کرده توسط قلم PAP دور برش را دایره کشیده، به سرعت در محلول مهارکننده­ی پراکسیداز

وارد می­کنیم و دوبار در PBS با PH 4/7  به مدت ۵ دقیقه شستشو می­دهیم.

۴) با سرم اسب NHS 3درصد به مدت ۳۰ دقیقه بافت را امکوبه می­کنی.

۵) اضافی NHS  را گرفته در طی شب در حرارت اتاق با آنتی­بادی اولیه که به­طور متناسب با NHS 3درصد انکوبه

شده است رقیق می­کنیم.

۶) دوبار شستشو با PBS همانند مرحله ۳ اجرا شود.

۷) با آنتی­بادی ثانویه که به نسبت ۱ به ۵۰۰ با NHS رقیق شده باشد به مدت ۳۰ دقیقه در حرارت اتاق انکوبه می­کنیم.

۸) دوبار شستشو با PBS همانند مرحله­ی ۳ انجام می­شود.

۹) با استرپتو آویدین کنژوگه که با پرکسیداز که ب NHS به نسبت ۱ به ۱۵۰۰ رقیق شده به مدت ۶۰ دقیقه در حرارت اتاق انکوبه میکنیم.

۱۰) دوبار شستشو با PBS همانند مرحله­ی  انجام می­شود.

۱۱) محل سوبسترای پراکسیداز را اضافه می­کنیم. واکنش را به صورت ماکروسکوپی و میکروسپکی حدود ۱۰ الی ۲۰ دقیقه کنترل می­کنیم.

۱۲) یک­بار با PH PBS 4/7 می­شوئیم.

۱۳) با هماتوکسیلین مایر رنگ می­کنیم.

۱۴) آب­گیری و شفاف کرده و می­چسبانیم.

 

رنگ ­آمیزی برش­های بافتی که قبلاً رنگ شده­اند

Immunostaining of previously stained section

ابتدا لامل را برداشته و به­طور مختصر با اسید الکل رنگ­بری می­کنیم و سپس طبق دستور عمل رنگ­آمیزی

معمول رنگ می­کنیم. مطالعات نشان می­دهد که برایاکثر آنتی­ژن­ها می­توان اسلایدهای قبلاً رنگ شده استفاده کرد.

کنترل­ها (Controls)

در هربار رنگ­آمیزی باید از کنترل استفاده کرد. کنترل­ها مثبت از بافت­های طبیعی به دلیل اینکه حاوی مقادیر زیادی

آنتی­ژن هستند، زیاد مناسب نیستند؛ بلکه بهتر است از بافت­های تومورال به این منظور استفاده شود.

از کنترل­های مثبت داخلی هم می­توان استفاده کرد.

مثلاً رگ­های یک تومور برای Desmin و یا فاکتور هشت. کنترل منفی می­تواند بافت فاقد آن آنتی­ژن باشد یا اینکه

به جای استفاده از آنتی­بادی اولیه می­توان از یک سرم غیر ایمون و یا یک آنتی­بادی غیر مرتبط استفاده کرد.

آنتی­ بادی­ها (Antibodies)

کیفیت آنتی­بادی­های مصرف مستقیماً بر روی کیفیت رنگ­آمیزی تأثیر دارند. آنتی­ بادی­های منوکلونال وسعت تاژه­ای به ایمونوهیستوشیمی داده­اند. تهیه­ی آن­ها آسان بوده و بسیار اختصاصی هستند و تغییرات کمی در تولیدات مختلف

آن­ها وجود دارد، ولی واکنش آن­ها علیه یک اپی­توپ است نه کل آنتی­ژن؛ لذا از حساسیت کمتری نسبت به آنتی­بادی­ های پلی­کلونال برخوردار هستند.

توصیه می­شود هرگاه از آنتی­بادی جدیدی استفاده می­شود حساسیت و اختصاصی بودن آن بررسی گردد.

برای جلوگیری از تفصیر غلط نتایج فرد باید کاملاً با خصوصیات رنگ و شدت واکنس هر آنتی­بادی آشنا باشد.

0/5 ( 0 بازدید )

محصولات مرتبط

مطالب زیر را حتما بخوانید

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *