کروموژن­ها  (Chromogens)

کروموژن­ها  (Chromogens)

کروموژن­های گوناگونی برای سیستم­های آنزیمی مختلف وجود دارد. DAB رایج­ترین کروموژنی است که امروزه

استفاده می­شود.

رنگ قهو­ای واکنش به سهولت قابل رویت بوده و مقاومت آن نسبت به الکل، آن را برای طیف وسیعی از

رنگ­ آمیزی­ ها Counterstain و چسب­ ها مناسب می­سازد.

روش­ های تشدید واکنش (Enhancement methods)

یون­های فلزات یا ترکیبات آلی را می­توان به منظور تشدید رنگ محصولات کروموژن به ­کار برد. غوطه­ور کردن برش­های

رنگ شده در محلول ۵/۰% سولفات مس، شدت رنگ را افزایش داده و و رنگ واکنش نیز بسته به اینکه از چه

محلولی استفاده شده باشد تغییر می­­یابد؛ ولی اغلب آزمایشگاه­ها از این روش­ها استفاده نکرده و رنگ

قهوه­ای طلایی DAB را ترجیح می­دهند، چون حتی وقتی شدت رنگ بسیار کم است می­توان آن را تشخیص داد.

تشدید رنگ­ آمیزی توسط امیداوزل   (Imidazole enhancement)

پراکسیداسیون DAB توسط Horseradish Peroxidase به واسطه­ی برخی ترکیبات نیتروژنی افزایش می­یابد.

امیدازول یک نمونه از این موارد است که بسیار مؤثر بوده و سرعت اکسیداسیون DAB را در PH خنثی چندین برابر

و علاوه بر آن فعالیت پراکسیدازی کاذب هموگلوبین را مهار می­کند. افزودن ۰۱/۰ مول امیدزول به مخلوط

DAB- peroxidase باعث تشدید رنگ­آمیزی استروژن و برخی دیگر از انتی­ژن­ها می­شود.

تشدید رنگ ­آمیزی با استفاده مکرر از آنتی­­بادی اولیه  

(Enhancement by repeated application reagents)

روش دیگر برای تشدید رنگ­آمیزی در مواقعی که میزان آنتی­ژن کم است، استفاده­ی مکرر از آنتی­بادی اولیه است؛

به این صورت که ابتدا آنتی­بادی اولیه را ریخته و ۱ تا ۲ ساعت در دمای اتاق آنکوبه می­کنیم، سپس با PBS شسته

و آنگاه آنتی­بادی اولیه را می­ریزیم و یک شب در دمای ۴ درجه انکوبه می­کنیم.

فیکساسیون    (Fixation)

نحوه و نوع فیکساسیون بافت، در کیفیت ایمونوهیستوسیمی نقش کلیدی دارد.

در واقع کیفیت ایمونوهیستوشیمی فقط به همان خوبی فیکساسیون خواهد بود.مطالعات نشان می­دهد که روش­های فعلی فیکساسیون و تهیه­ی برش­های پارافینی میزان آنتی­ژن­های بافتی راکاهش می­دهد؛ به­خصوص آنتی­ژن­های سطحی سلول­ها که به میزان کم در برش­های انجمادی قابل تشخیص هستند

در طی فرآیند فیکساسیون و تهیه­ی روتین بافت از بین می­روند و قابل شناسایی نیستند و درواقع gold standard برای حفظ آنتی­ژن­های سلول روش­های انجمادی است. به­خصوص آنتی­ژن­های سطحی لنفوسیت­ها ناپایدار بوده و برش­های انجمادی برای آن­ها مناسب­تر است.

هنوز متداول­ترین فیکساتیوی که در آزمایشگاه­های تشخیصی به­کار می­رود فرمالین است. میزان بقاء آنتی­ژن

به طور معکوس با طوب زمان فیکساسیون با فرمالین نسبت دارد. براساس مطالعات انجام شده میزان برخی از

آنتی­ژن­ها پس از سه روز فیکساسیون کاهش نشان داده ولی اغلب آن­ها پس از ۷ روز بودن در مجاورت فرمالین

کاهش قابل ملاحظه نشان می­دهد. بنابراین بافت­هایی که چندین روز در فرمالین مانده­اند برای انجان رنگ ­آمیزی­ها ایمونوهیستوشیمی مناسب نیستند.

نمک فلزات روی رسوب­دهنده­ های قوی پروتئین بوده و ایجاد کمپلکس­های غیرمحلول با پلی­پپتیدها می­کنند،

لذا استفاده از فرمالین روی zinc Formalin به عنوان فیکساتیو می­تواند شدت رنگ­امیزی را افزایش دهد

(۱ درصد سولفات روی در ۷/۳ درصد فرمالین).

فیکساسیون با ماکروویو    (Microeave fixation)

جایگزینی فیکساسیون فرمالین با Microwave نه تنها باعث سرعت و تمیز بودن بودن کار می­شود بلکه از

نقطه نظرحفظ آنتی­ژن­های سلولی نیز به فرمالین ازجحیت دارد.

نمونه در فرمالین به آزمایشگاه آورزده می­شود و به محض ورود بررسی شده و برش­های با ضخامت ۲mm تهیه

و به تعداد ۴۰ برش در حرارت ۶۲ درجه در داخل سالین نرمال درون Microwave قرار داده می­شود.

پس از آن در Tissue processor طی چندین مرحله از الکل مطلق (۷۵ دقیقه) کلروفرم یا گزیلل (۵۰ دقیقه)

و موم (۵۰ دقیقه) می­گذرد.

به اشتثناء سائیوکراتین و دسیمن، بافت­هایی که به این روش تهیه می­شوند نیاز به استفاده از آنزیم­های

پروتئولیتیک برای افزایش شدت رنگ­امیزی ندارند.

0/5 ( 0 بازدید )

محصولات مرتبط

بازدید: 7

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *


دانلود اپلیکیشن اندروید پارامد پارامد-اپلیکیشن رد کردن