دانشنامه پارامد نمایشگاه تجهیزات آزمایشگاهی و پزشکی پارامد
الکتروفورزبر روى ژل پلى‌الکريل‌آميد وSDS-PAGE
در مواردی که لازم است یک پروتئین را با حفظ فعالیت کاتالیتیک آن جدا نمود الکتروفورز بر روی ژل پلی‌اکریل‌آمید انجام می‌گیرد. بار یونی، اندازه و شکل پروتئین‌ها از عوامل موثر در جداسازی این مولکول‌ها توسط PAGE[1] می‌باشد. نوع و شرایط بافری مناسب برای PAGE برخلاف SDS-PAGE به پروتئین مورد مطالعه بستگی داشته و به طور تجربی به دست می‌آید. در این روش به‌کاربردن هر نوع بافر در طیف ۱۱-۳= pH است ولی باید در نظر داشت که pH مورد نظر بر روی خصوصیات ساختمان پروتئین اثر می‌گذارد لذا بهتر است محلول مورد نظر از قدرت بافری کمی برخوردار باشد تا تاثیر آن بر روی ساختمان پروتئین کم شود.
در بسیاری از روش‌های به‌کار گرفته شده در الکتروفورز برای جداسازی پروتئین‌ها از ترکیباتی استفاده می‌شود که رشته‌های پلی‌پپتید را از یکدیگر جدا می‌سازند. ترکیباتی که برای این منظور به‌کار گرفته می‌شوند عبارتند از دترژانت یونی سدیم دودسیل سولفات (SDS) و سنیل پیرینیم (CPCI). پروتئین‌ها در حضور SDS و یک احیاکننده مانند ۲ مرکاپتواتانل یا دی تیوتریتول در ۱۰۰ درجه سانتی‌گراد دناتوره می‌شوند. سدیم دودسیل سولفات یک دتر ژنت آنیونیک[2] می‌باشد که به مقدار زیاد به پروتئین‌ها متصل شده و پیوندهای غیرکوالان را در پروتئین‌ها قطع می‌کند. همچنین با یکسان کردن بار الکتریکی درونی آن‌ها باعث بازشدن چین‌های[3] پروتئین می‌شود.
آنیون‌های SDS طوری به زنجیره اصلی اتصال می‌یابند که در مقابل هر مولکول SDS دو آمینواسید قرار می‌گیرد. پیوستن SDS به پلی‌پپتیدها اثر زیادی بر ساختمان پلی‌پپتید نمی‌گذارد اما اتصال SDS، بار منفی پروتئین را بسیار افزایش می‌دهد. بار منفی ایجاد شده بسیار بیشتر از بار پروتئین خالص بوده و بدین علت قدرت کافی برای تفکیک بیشتر پروتئین را تأمین می‌کند. از آنجائی که بار منفی ایجاد شده به علت اتصال SDS به مولکول پروتئین، متناسب با میزان وزنی مولکول می‌باشد، لذا حرکت الکتروفورزی مولکول نیز متناسب با وزن مولکولی خواهد بود. تفکیک شدن بر روی ژل پلی‌اکریل‌آمید نیز مستقیماً در ارتباط با عوامل بازدارنده مانند اندازه مولکول می‌باشد. بدین صورت که بزرگی مولکول باعث کاهش سرعت آن می‌شود.
اندازه مولکولی یک پروتئین ناشناخته نیز از روی مقایسه حرکت الکتروفورزی آن با حرکت الکتروفورزی پروتئینی که وزن مولکولی آن مشخص می‌باشند تعیین می‌گردد. کمپلکس SDS با پروتئین بر روی ژل پلی‌اکریل‌آمید در مسیر بالا به پایین الکتروفورز می‌شود و حرکت زنجیره‌های پلی‌پپتیدی از بالا به پایین صورت می‌گیرد. بدین معنی که پروتئین‌های کوچک به راحتی و با سرعت در ژل پلی‌اکریل‌آمید حرکت می‌کنند ولی مولکول‌های بزرگ در قسمت بالای ژل، نزدیک به محل نمونه‌گذاری باقی می‌مانند. حرکت زنجیردهای پلی‌پپتیدی در بیشتر موارد بالگاریتم حجم مولکول‌ها رابطه‌ای مستقیم دارند امّا بعضی از پروتئین‌ها مخصوصاً آن‌هائی که کر بوئیدرات زیادی دارند از قانون فوق تبعیت نمی‌کنند.
در صورتی‌که SDS همراه با مواد احیای کننده (مانند مرکاپتواتانلی یادی تیوتریتول که پیوندهای دی‌سولفیدی را از بین می‌برند) به کار رود تمام پروتئین‌ها شکل فضایی[4] یکسانی خواهند گرفت. مزیت عملی اینکار که در تکنیک SDSPAGE به کار می‌رود این است که حرکت مولکول در میدان الکتریکی فقط براساس جرم آن‌ها بوده و بنابراین اطلاعاتی در مورد جرم آن نیز حاصل خواهد شد.
همچنین می‌توان با استفاده از اوره ساختمان سه بعدی پروتئین را گسست. اوره با گسستن پیوندها، پروتئین‌ها را دناتوره می‌کند (اوره در غلظت ۸ مولار به کار گرفته می‌شود). برخلاف SDS، اوره بار کلی پروتئین را تغییر نمی‌دهد، بنابراین در شرایطی که اوره به کار گرفته می‌شود جداسازی برحسب وزن مولکولی و بار یونی خواهد بود. البته باید توجه داشت که SDS ترکیب دناتوره کننده بهتری در مقایسه با اوره است و در حضور نور درصد زیادی از پروتئین‌های سلول از هم جدا شده و وارد ژل می‌شود در حالی که در حضور اوره این میزان از ۵۰ درصد فراتر نمی‌رود. البته جداکردن پروتئین‌ها از یکدیگر و وارد ساختن آن‌ها به SDS-PAGE در حضور اوره بصورت تواماً الزامی است.
بعد از انجام الکتروفورز باندهای تفکیک شده را با رنگ نقره[5] یا کوماسی بلو رنگ‌آمیزی می‌کنند. با کمک رنگ‌آمیزی کوماسی‌بلو پروتئین‌ها تا حد کمتر از 1/0 میکروگرم قابل تشخیص می‌باشند. حساسیت اندازه‌گیری را می‌توان با رنگ‌آمیزی نقره تا حد 02/0 میکروگرم افزایش داد. با این حساسیت، دو پروتئین با اختلاف در ۱۰ اسید آمینه را می‌توان از یکدیگر تفکیک نمود.
این روش کم هزینه، سریع و تکرارپذیر بوده و آن را حتی می‌توان برای خالص سازی مقادیر کم پروتئین‌ها نیز به کار برد. به همین دلیل امروزه SDS-PAGE پر استفاده‌ترین روش در میان روش‌های الکتروفورز می‌باشد. قابلیت تفکیک بسیار بالای این روش عمدتاً ناشی از وجود سدیم دودسیل سولفات (SDS) و ویژگی مناسب ژل اکریل‌آمیددر غربال کردن اندازه‌های مختلف مولکولی است.
[1]– Poly Acrylamide Gel Elevtrophorecsis
[2]– Anionic Detergent
[3]– Fold
[4]– Configuration
[5]– Silver Stain